En biologie moléculaire, un bon choix de tampon et une bonne préparation pour différentes étapes d'isolement de l'ADN peuvent faire la différence entre passer à l'expression de protéines ou ouvrir un autre kit de maxi-prep pour recommencer. En dépit de leur importance cruciale, les recettes tampons ne sont souvent que cela - des recettes écrites sans explication ni justification des différents composants. Un tel tampon est le tampon glucose-tris-EDTA ou GTE.
$config[code] not foundA quoi sert GTE?
Le GTE est utilisé pour remettre en suspension des pastilles de cellules bactériennes avant de lyser (ouvrir) les cellules et de récolter l'ADN plasmidique à l'intérieur. Le lysozyme, qui ramollit les membranes cellulaires, est souvent ajouté avec le tampon GTE. L'obtention d'une suspension homogène de cellules entières au cours de cette étape, de sorte que la solution de lyse ajoutée par la suite puisse atteindre toutes les cellules est essentielle pour obtenir de bons rendements en ADN. GTE est conçu pour cela tout en offrant un environnement stable à l'ADN.
Le glucose pour l'osmolarité
Du sucre de glucose à 50 mM (millimolaire) est ajouté au tampon GTE pour maintenir l'osmolarité lorsque la concentration de soluté à l'extérieur des cellules est proche de celle à l'intérieur des cellules. Cela empêche la lyse prématurée des cellules, ce qui peut entraîner une baisse des rendements en ADN en raison de l'agrégation et de la dégradation. Les autres composants du tampon contribuent également à l'osmolarité de la solution, mais le glucose, étant un non-électrolyte, est un bon choix car il n'interfère pas avec les propriétés du tampon de la solution.
Tris pour la stabilité du pH
Tris est le nom abrégé de tris (hydroxyméthyl) aminométhane, qui est un tampon de pH très courant. Dans le cas du tampon GTE, le sel d'acide (Tris-HCl) est ajouté au tampon à une concentration de 25 mM. Ceci maintient le pH de la solution à une valeur quasi physiologique de 8,0, un pH idéal pour empêcher l'hydrolyse acide (dégradation) de l'ADN plasmidique et les réactions secondaires indésirables des autres composants de la cellule.
L'EDTA prévient la dégradation de l'ADN
L'EDTA, ou acide éthylènediaminetétraacétique, capture ou "chélate" les ions métalliques en solution, les empêchant de participer à des réactions secondaires non désirées. Dans le tampon GTE, l’EDTA est ajouté à 10 mM. Son objectif principal est de permettre au tampon d’arrondir le zinc, le magnésium et le calcium libres, empêchant ainsi la dégradation de l’ADN par certaines voies nécessitant ces métaux.
Quelques conseils importants
Gardez votre tampon GTE au froid et fabriquez-le en petites quantités pour empêcher la croissance de bactéries non intentionnelles. Le sucre et le pH contrôlé constituent un excellent milieu de croissance. Toujours utiliser de l'eau purifiée. L'eau du robinet peut contenir un excès d'ions métalliques provenant des tuyaux, ce qui peut surcharger la capacité de capture de l'EDTA. Si vous suspectez la présence d'ARN interférant dans votre échantillon, ajoutez de la RNase A à 100 microgrammes par millilitre à votre tampon GTE pour éliminer le problème.
